【飛諾美色譜】色譜小知識 | 準(zhǔn)確配置流動相的重要性

更新時(shí)間：2024-12-02

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原文作者– Helen Whitby, PhD

翻譯作者- Kevin Zhao, M.S., MBA

緩沖溶液是指由弱酸及其共軛堿（或弱堿及其共軛酸）所組成的緩沖對配制的，且能夠在加入少量強(qiáng)酸或強(qiáng)堿時(shí)，可以有效減緩pH值改變的水溶液。緩沖溶液能幫助維持分析方法的穩(wěn)定，而不會因?yàn)槲⑷醯沫h(huán)境改變的情況下而造成分析結(jié)果的改變。

緩沖溶液是被用來維持pH值的穩(wěn)定。它們是通過維持弱酸及其共軛堿的平衡從而防止了pH值的改變。

緩沖溶液是如何工作的？

根據(jù)Le Chatelier原理，當(dāng)一些強(qiáng)酸 (或者更多的氫離子“H+") 加入到弱酸及其共軛堿的平衡混合物中時(shí)，平衡會被向左移動。同樣，如果在混合物中加入強(qiáng)堿，氫離子濃度下降的幅度會小于所預(yù)期加入堿的量。

當(dāng)配制緩沖溶液時(shí)你應(yīng)該遵循以下幾個(gè)原則

在配制緩沖液前，建議用定值校準(zhǔn)緩沖液標(biāo)準(zhǔn)品來校對電子pH計(jì)
根據(jù)所需緩沖液的濃度，精確地稱出所需緩沖鹽的重量
把所需的緩沖鹽加到已經(jīng)裝有HPLC色譜級超純水的容量燒瓶中，并充分?jǐn)嚢柚寥芙?/p>
使用pH探針或pH計(jì)去測量溶液的pH值
通過添加少量的強(qiáng)酸或強(qiáng)堿，將容液的pH值調(diào)整至所需的值
調(diào)整至所需pH值后，將溶液用色譜級超純水稀釋至最終的所需體積容量，并混合均勻

HPLC緩沖液通常用于控制在液相色譜分析中所不希望出現(xiàn)的二次相互作用。此外，緩沖液也被用來工作分析物的電離狀態(tài)，以確保分析物不會同時(shí)出現(xiàn)一個(gè)以上的電離狀態(tài)。

化合物的pKa值代表此化合物的50%離子化和50%中性時(shí)的pH值。如果在此pH值下分析此化合物，你會看到分裂峰的出現(xiàn)或者不穩(wěn)定的保留時(shí)間。因此，我們建議所有的分析方法的pH值都應(yīng)該控制在目標(biāo)分析化合物的pKa值正負(fù)兩個(gè)pH單位以上。

當(dāng)配制等度流動相的時(shí)候，我們還需要考慮以下幾個(gè)因素來確保方法的穩(wěn)定

盡可能提前預(yù)混合你所使用的流動相，因?yàn)檫@將防止經(jīng)過泵混合流動相時(shí)會出現(xiàn)的錯(cuò)誤
每一次都需要始終使用相同的配制方法及流程。例如，如果你方法是先加水，那你每次都必須是先加水。如果你是先測定單獨(dú)的成分然后再混合，那你就必須每次都按這個(gè)流程來做。記得千萬不要改變這一個(gè)固定的配制流程，因?yàn)檫@個(gè)配制流程的改變讓分析物的保留時(shí)間可能出現(xiàn)很大的改變

以下的這個(gè)實(shí)驗(yàn)例子展示了當(dāng)流動相用以下不同的方式來混合時(shí)，峰保留時(shí)間可能出現(xiàn)的改變

方法一

先加水：先用量筒量400毫升的水并倒進(jìn)1升的容量瓶中，然后用甲醇稀釋至容量瓶的刻度

方法二

先加甲醇：先用量筒量600毫升的甲醇并倒進(jìn)1升的容量瓶中，然后用水稀釋至容量瓶的刻度

方法三

甲醇和水各自先量好：先用量筒量600毫升的甲醇并倒進(jìn)流動相瓶中，然后用同樣的量筒量400毫升的水并倒進(jìn)已經(jīng)裝有甲醇的流動相瓶中

方法四

讓液相的泵來混合A瓶中的水和B瓶中的甲醇

緩沖液的濃度也是很重要的。我們一般認(rèn)為，10mM以下的濃度不足夠提供可以控制化合物硅醇活性或者電離狀態(tài)所需要的緩沖能力，因此10mM是反相或者HILIC色譜模式下的低有效濃度。對于其他色譜模式，如體積排阻色譜就需要更高的緩沖液濃度，使用超過100mM濃度的緩沖液在體積排阻色譜法中并不罕見。

緩沖液的濃度必須非常精確地平衡好，以確保在所有的條件下都能達(dá)到溶解。在反相條件下，如果方法條件是包含了高比例有機(jī)相的話（例如跨度很大的梯度），則很有可能需要控制緩沖液的濃度，以確保不會出現(xiàn)緩沖鹽的析出。

當(dāng)開發(fā)一個(gè)可靠穩(wěn)定的HPLC方法時(shí)，流動相的貢獻(xiàn)跟色譜柱固定相的選擇性一樣重要，另外流動相的選擇與配制跟色譜柱固定相批次間的質(zhì)檢也是一樣重要的。

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