體積排阻色譜（SEC）：大分子分離的“分子篩”奧秘

更新時(shí)間：2025-03-13

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你是否好奇科學(xué)家如何精確分析多肽、蛋白質(zhì)、聚合物甚至病毒顆粒的分子量？答案就藏在**體積排阻色譜（SEC）**的奇妙世界中！今天，讓我們揭開 SEC 固定相的神秘面紗，探索它如何成為實(shí)驗(yàn)室的“分子尺子"！

SEC 的核心：尺寸決定命運(yùn)！

SEC 的原理簡(jiǎn)單卻強(qiáng)大——大分子先出，小分子后出！固定相由多孔填料組成，分子像“賽跑選手"一樣穿過孔道：

大分子因體積過大，直接被“拒之門外"，快速洗脫（排阻體積）。

小分子能鉆進(jìn)孔隙“迷宮"，洗脫時(shí)間更長(zhǎng)（滲透體積）。

下圖所示為 SEC 色譜圖中化合物尺寸與洗脫的關(guān)系。一個(gè)常見的誤解是 SEC 基于分子量分離分子。大多數(shù)情況下確實(shí)是這樣，分子量較大的分析物通常會(huì)先洗脫。不過，更準(zhǔn)確的說法是 SEC 基于流體力學(xué)體積分離分子，即分子在流動(dòng)相或溶劑中的有效大小。

SEC 通常分為兩種不同的類型：

凝膠過濾色譜法（GFC）：使用水溶液作為流動(dòng)相

凝膠滲透色譜法（GPC）：使用有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相

雖然 SEC 包括 GFC 和 GPC 兩種不同類型的分析，但大多數(shù)科學(xué)家并不對(duì)其進(jìn)行區(qū)分。科學(xué)家經(jīng)常交換使用 GPC 和SEC。他們經(jīng)常會(huì)稱自己的工作為水相 GPC/SEC 或非水相 GPC/SEC，而不是 GPC 或 GFC。

固定相：硅膠 VS 聚合物，誰(shuí)主沉浮？

SEC 色譜柱的固定相可以是硅膠基質(zhì)或聚合物基質(zhì)。硅膠基質(zhì)色譜柱與極性基團(tuán)（通常為二醇）鍵合，以防止與分析物產(chǎn)生離子相互作用。聚合物基質(zhì)色譜柱使用疏水性或極性指數(shù)與樣品相似的聚合物填料。可以從下表的整理中發(fā)現(xiàn)，兩種固定相各有各的優(yōu)劣勢(shì)。

按照上述對(duì)比，我們可以大致得出一個(gè)寬泛的結(jié)論：高分辨率快速分離、以及常規(guī)分析可以優(yōu)選硅膠基質(zhì)，且緩沖液+硅膠柱的搭配更適合親水性生物分子（如蛋白）；對(duì)于極-端 pH 或有機(jī)溶劑條件，以及分析超大分子（如病毒顆粒、合成高分子）的時(shí)候，聚合物基質(zhì)更優(yōu)。

實(shí)戰(zhàn)技巧：如何玩轉(zhuǎn) SEC？

SEC 填料為全多孔，通過不同孔徑進(jìn)行分離。孔的體積越大，SEC 填料的分離能力越強(qiáng)。排阻體積（Vo）對(duì)應(yīng)固定相孔排除的化合物洗脫所需的流動(dòng)相體積。總滲透體積（Vt）是尺寸足夠小、可以進(jìn)入固定相孔的化合物洗脫所需的流動(dòng)相體積。化合物分離發(fā)生在排阻體積與總滲透體積之間。這個(gè)體積用填料的總孔體積表示（參見下圖）。最終，SEC 填料的孔徑將決定色譜柱的排阻范圍，或排阻體積與滲透體積之間的對(duì)應(yīng)分子量范圍。

基于上述原理，在使用 SEC 的過程中，我們可以利用以下實(shí)用攻略：

串聯(lián)色譜柱：

同孔徑串聯(lián)（如雙 50? 柱）→通過延長(zhǎng)柱長(zhǎng)提高理論塔板數(shù)，增強(qiáng)對(duì)分子量接近組分的分離分辨率。

不同孔徑串聯(lián)（如 50?+1000?）→擴(kuò)展分離分子量范圍，兼顧小分子片段與大分子聚集體的同步檢測(cè)。注意需要將大孔徑柱置于前端，避免小孔徑柱堵塞風(fēng)險(xiǎn)。

選擇合適的填料孔徑：

需確保目標(biāo)分子處于填料的線性分離區(qū)間（介于排阻極限與滲透極限之間），按照核心公式（經(jīng)驗(yàn)法則）：

球形分子（如蛋白質(zhì)、抗體）：

孔徑（?）≈ 分子量（kDa）× 1.5

例：150 kDa 單抗 → 200-300 ?。雖然選擇 200? 和 300? 都是滿足排阻范圍的，但是 200? 可以在保證聚集體分離的前提下，帶來更好的片段分離能力，實(shí)現(xiàn)更全面的質(zhì)量監(jiān)控。

線性/柔性分子（如核酸、多糖、PEG）：

孔徑（?）≈ 分子量（kDa）× 2.0

例：5,000 nt mRNA ≈ 1,500 kDa → 700-1,000 ?。對(duì)于 5000 nt 以下的 mRNA，選擇 700 ?（貼近計(jì)算值下限），能夠帶來更高的分辨率。

Phenomenex SEC 產(chǎn)品亮點(diǎn)

Biozen dSEC-2 & dSEC-7：通過生物惰性系統(tǒng)與親水化硅膠填料的協(xié)同設(shè)計(jì)，為生物藥關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）分析提供更靈敏、更穩(wěn)定的分離平臺(tái)。

Yarra & Biosep：專為多肽，蛋白質(zhì)分離而生。

Polysep：聚合物基質(zhì)搭配 GFC 分析，輕松應(yīng)對(duì)多糖等復(fù)雜樣本。

Phenogel：聚合物柱的“多面手"，覆蓋從 PS（聚苯乙烯）到 PEG（聚乙二醇）的全場(chǎng)景 GPC 需求。

未來展望

隨著生物藥與復(fù)雜制劑（mRNA/AAV/ADC）的爆發(fā)式增長(zhǎng)，高通量、高精度 SEC 平臺(tái)已成為研發(fā)質(zhì)控的核心剛需。Phenomenex SEC 色譜技術(shù)持續(xù)賦能，為生物醫(yī)藥“關(guān)鍵質(zhì)量屬性"提供更優(yōu)異的分離保障！

TEL：15631952082