【飛諾美色譜】小環(huán)狀干擾RNA(sciRNAs)作為基因沉默的有效治療平臺

更新時間：2024-12-06

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摘要

為了實現(xiàn)由RNA干擾(RNAi)途徑介導的有效的治療性轉錄后基因沉默，必須對小干擾RNA(siRNA)進行化學修飾。幾種具有穩(wěn)定siRNA代謝潛力的超RNA結構已被評估其誘導基因沉默的能力，但它們都有局限性或尚未在治療相關背景下進行探索。共價閉合環(huán)狀RNA轉錄物在真核生物中普遍存在，具有作為生物標志物和疾病靶點的潛力，環(huán)狀RNA模擬物正在被探索用于治療。在這里，我們報道了小環(huán)狀干擾RNA(sciRNAs)的合成和評價。為了合成sciRNA，用三價N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)配體功能化并使用“click"化學環(huán)化的正義鏈被退火成反義鏈。這種策略用于合成小圓環(huán)，但也可用于合成較大的環(huán)狀RNA模擬物。我們在體外和體內(nèi)評估了各種sciRNA設計。我們觀察到循環(huán)后正義鏈的代謝穩(wěn)定性得到改善，脫靶效應被消除。反義鏈的5'-(E)-乙烯基膦酸鹽修飾導致GalNAc-sciRNA在體內(nèi)的治療相關劑量有效。物理化學研究和基于核磁共振的結構分析，以及分子模型研究，揭示了這類具有部分雙鏈特征的新型siRNA與RNAi機制的相互作用。

圖1 (A) sciRNA中使用的化學修飾。(B) GalNAc -偶聯(lián)sciRNA示意圖。

圖2 sciRNA-GalNAc偶聯(lián)物點擊環(huán)正義鏈的合成。簡稱:Q, 6-疊氮己基柄; Y: 炔羥基脯氨酸磷酰胺; L, GalNAc配體; Z, 連接子。

表1 線性GalNAc-siRNA和環(huán)狀GalNAc-siRNA的序列、熱穩(wěn)定性和體外效力。

正義鏈序列是最上面的行;反義鏈序列為底行。Z表示環(huán)狀寡核苷酸。化學修飾如下：•，PS鍵; 小寫的核苷酸，2'-OMe; 大寫的核苷酸用斜體表示，2'-F; Q,6-azidohexyl-phosphate; 副VP,5'-(E)-vinylphosphonate。

血漿和肝臟勻漿中寡核苷酸穩(wěn)定性分析

用10倍輔助因子溶液稀釋大鼠血漿(BioIVT,Cat# RAT00PL38NCXNN)和肝臟勻漿(BioIVT，定制訂單)，最終濃度為1mM MgCl2, 1mM MnCl2和2mM CaCl2。將sciRNA加入到50μl的血漿或肝臟勻漿中，最終濃度為20μg/ml。反應混合物在37℃下輕搖孵育。在每個預定時間點(0,1,4,8和24h)，加入450μL含有內(nèi)標(寡核苷酸U21，終濃度為1μg/ml)的Clarity OTX裂解上樣緩沖液(Phenomenex,Cat# AL0-8579)停止反應，并在-80°C冷凍至分析。實驗一式三次。

使用Liu等人(49)描述的Clarity OTX 96孔固相萃取板進行LC-MS分析的寡核苷酸富集。固相萃取柱初始用1 ml甲醇，然后用2ml 50mM醋酸銨和2mM在HPLC級水中平衡。樣品通過正壓加載到固相萃取柱上。然后用1ml 50mM乙酸銨在50/50(v/v)水和乙腈(pH5.5)中洗滌5次。最后，用含有10mM EDTA, 100mM碳酸氫銨的洗脫緩沖液在40/10/50(v/v/v)乙腈/四氫呋喃/水(pH8.8)中洗脫寡核苷酸。洗脫液在氮氣下干燥，重懸于120μl LC-MS級水中進行LC-MS分析。

結果

大鼠血漿和肝臟勻漿已被用于表征GalNAc偶聯(lián)寡核苷酸的代謝。在長達8小時的血漿中檢測到環(huán)狀或線性siRNA鏈均未降解(圖4A)。然而，在我們的LC-MS代謝物分析中，我們觀察到在大鼠血漿中孵育24小時后，環(huán)狀鏈上增加了一個水分子。從大鼠肝臟勻漿或血漿中鑒定si-4的代謝物見補充表S4，從大鼠肝臟勻漿或血漿中鑒定si-5的代謝物見補充表S5。我們的理論認為，這種物種是由于開放的環(huán)狀結構產(chǎn)生線性化的寡核苷酸。在大鼠肝臟勻漿中，環(huán)形sciRNA(si-4和si-5)比線性sciRNA(si-3)更穩(wěn)定。在24h時si-4或si-5沒有降解，而對于si-3，在24h時僅檢測到全長正義鏈的約55%(圖4B)。與具有4小時半衰期的線性siRNA相比，sciRNA的半衰期明顯更長，為29和30小時。這與單鏈穩(wěn)定性分析的結果有關，其中環(huán)化增強了外切酶存在下的穩(wěn)定性。在肝臟勻漿中，我們沒有觀察到si-4或si-5的正義鏈的環(huán)狀結構打開。

圖4 線性GalNAc-siRNA si-3和GalNAc-sciRNAs與環(huán)狀正義鏈si-4和si-5在血漿和肝臟勻漿中孵育后全長正義鏈的穩(wěn)定性使用LC-MS測量。(A)大鼠血漿或(B)大鼠肝臟勻漿中剩余全長正義鏈百分比(log10)。用誤差條表示每個時間點三個重復的標準差。

結論

作為RNAi療法，sciRNAs可以提供包括代謝穩(wěn)定在內(nèi)的有益特性，從而延長作用時間，減少脫靶結合。進一步的環(huán)狀RNA結構可以設計成定制的三維結構，從而影響組織分布和組織保留，最大限度地減少不希望的蛋白質(zhì)結合，并優(yōu)化由于物理性質(zhì)變化而導致的配體-受體相互作用。在RNAi治療的當前前景中，許多已批準的藥物和人類臨床試驗中的高級候選藥物已經(jīng)優(yōu)化為靶向遞送到肝臟。類似的藥物設計規(guī)則是否會普遍適用于siRNA成功遞送到肝外組織和各種相關細胞類型，還有待觀察。沿著這些具有挑戰(zhàn)性的路線工作，需要探索新的化學和結構修飾類別。了解結構基序對效力和安全性的影響將為未來開發(fā)細胞和組織特異性遞送RNAi療法鋪平道路。具有修飾結構的siRNA也將擴展RNAi療法的工具箱，當將脫靶減少和增強代謝穩(wěn)定納入初始RNAi篩選過程時，將提供額外的益處。

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