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【飛諾美色譜】核苷-Bio的源動力和加速器
更新時間：2024-12-10
點擊次數：711
核苷由堿基及核糖構成，是生物體內用于合成遺傳物質（DNA和RNA）的重要原料！除8種常見核苷外，還存在多種天然修飾核苷以及經過結構優化的化學合成的修飾核苷。修飾核苷主要用作各類核苷類藥物（抗癌藥物等）的研發以及作為合成小核酸藥物的原料等。
01
隨著瑞德西韋被FDA批準為治療的藥物，核苷類藥物以及相關衍生藥物再次受到醫學界的廣泛關注，它是臨床上用于治療病毒感染性疾病、腫瘤、艾滋病等的一類重要的藥物。
在藥物研發的進程中，為了提升核苷類分子的藥動學和藥效學性質，常針對核苷的堿基、糖苷鍵、糖環等進行修飾，從而降低核酸類藥物的免疫原性并提升穩定性，經常需要開發對應的雜質分析和原料檢測方法。
案例1：對胞磷膽堿鈉及相關化合物分析
色譜條件
色譜柱：Gemini 5µm NX-C18, 4.6×250mm
流動相：磷酸三乙胺緩沖液
流速：0.5mL/min
柱溫：30℃
進樣量：20µL
波長：276nm
02
假尿苷（Pseudouridine）是RNA上豐富的修飾核苷，又被稱為RNA的“第五種核苷"。2005年，Katalin Karikó等人發現將假尿苷引入RNA中能降低其免疫原性，并且RNA的免疫原性隨著假尿苷引入比例的增高而降低。2008年，Katalin Karikó等人還發現用假尿苷替代尿苷的mRNA不僅能極大地降低mRNA的免疫原性，還能提高mRNA的穩定性并增強其翻譯能力。2015年，Oliwia Andries等人發現用N1-甲基假尿苷替代尿苷比用假尿苷替代尿苷更能降低mRNA的免疫原性，且更能增強mRNA的蛋白表達能力。
這些研究提示，將假尿苷或N1-甲基假尿苷引入mRNA或許能有效降低mRNA疫苗的免疫原性，增強mRNA的穩定性，且增強其蛋白表達能力。
我們在IVT反應過程中，對反應體系中各種有效組分進行實時監控非常關鍵。
案例2：幾種三磷酸尿苷的類似物用液相色譜法快速檢測
色譜柱：Kinetex Biphenyl 100?（3.0×150mm, 2.6μm）; P/N:00F-4622-Y0
流動相A：150mM三乙胺+15mM正己胺（用磷酸調節pH至7.8）
流動相B：甲醇
流速：0.5mL/min
檢測器：260nm
柱溫：40℃
自動進樣器溫度：8℃
| 時間（min） | A（%） | B（%） |
| 0 | 85 | 15 |
| 20 | 75 | 25 |
| 20.1 | 85 | 15 |
| 25 | 85 | 15 |
圖1. Kinetex Biphenyl上3種類似物混標丨譜圖
因為三個類似物的結構高度相似，特別是UTP和Me-pUTP，疏水性極為相似，用普通的C18反相色譜柱難以分離。通過色譜柱篩選，我們發現Kinetex Biphenyl核殼固定相由于芳香族特殊的選擇性，可以對幾種同系物分離，該方法可以用于反應體系中組分的快速檢測。
我們再展開一下
03
mRNA藥物生產工藝大致可分為5個模塊：質粒生產、質粒線性化、體外轉錄合成反應（IVT）、mRNA純化、LNP包封。針對mRNA的批量合成，目前較為高效的方式為體外轉錄（In Vitro Transcription, IVT）。IVT是一個相對復雜的酶催化過程，在合成mRNA的過程中，除DNA模板外，需加入所需的酶、三磷酸核苷酸及其它相關試劑。
三磷酸核苷酸極性很強，在反相色譜上保留很弱，由于結構非常相似，不能實現良好分離。通過添加離子對試劑來增強三磷酸核苷在C18色譜柱上的保留并改善分離。
案例3：5種三磷酸核苷酸單體的IP-RP分離
色譜柱1：Biozen Oligo（4.6×150mm, 2.6μm）; P/N:00F-4790-E0
色譜柱2：Clarity Oligo-RP（4.6×150mm, 3μm）; P/N:00F-4441-E0
流動相A：150mM三乙胺+15mM正己胺（用磷酸調節pH至7.8）
流動相B：流動相A:乙腈（1:1）
流速：0.8mL/min
檢測器：260nm
柱溫：50℃
自動進樣器溫度：8℃
進樣量：1µL
| 時間（min） | A（%） | B（%） |
| 0 | 85 | 15 |
| 20 | 75 | 25 |
| 20.1 | 85 | 15 |
| 25 | 85 | 15 |
圖1. 色譜柱1 Biozen Oligo混標譜圖
圖3. 色譜柱2 ClarityOligo-RP混標譜圖
因為三磷酸核苷酸的親水性很強，在磷酸鹽緩沖體系下的保留偏弱，分離度也不好。在反相離子對條件下可以發現保留明顯增強，并且5個單體都可以很好的分離。
Biozen Oligo為2.6µm的核殼顆粒，跟3µm全多孔硅膠顆粒的Clarity Oligo-RP相比，可以看到峰更加尖銳，柱效和分離度更高；而后者的保留略強，峰的對稱性更好。
反相離子對色譜條件需要在流動相中添加烷基胺類離子對試劑，流動相的pH比較高。如果是傳統的硅膠顆粒C18柱，對壽命會有挑戰。Biozen Oligo 2.6µm和Clarity Oligo-RP 3µm兩款色譜柱均采用雜化硅膠技術，色譜柱可以耐受1-12的pH，更經久耐用。
案例4：分離CTGA四個核苷酸
色譜柱：Venusil AQ C18 10µm 21.2×250mm
流動相：A: 水（50mM甲酸銨） B: 甲醇:水=20:80
流速：20ml/min
波長：260nm, 280nm
進樣量：1400µL（100mM單體CTGA各100µL混合后加流動相A 1mL）
| Time | B% |
| 0 | 0 |
| 11 | 0 |
| 20 | 100 |
Agela AQ C18 10µm填料，用甲酸銨的方法可以分離CTGA四個核苷酸。
案例5：改性核苷酸樣品制備
儀器：Agela Astra中壓制備系統
色譜柱：Flash HILIC 20-35μm 100? 4g四支串聯
流動相：A: 水（25mM乙酸銨） B: 乙腈:水=75:25（25mM乙酸銨, pH6.7）
流速：15ml/min
檢測波長：260nm; 220nm
進樣量：20mg
| Time | B% |
| 0 | 100 |
| 40 | 87 |
繼續皮一下，
彩蛋依舊是熱點應用分享
1
對五種關鍵核苷進?了全?HPLC分析：腺苷、?苷、尿苷、胞嘧啶和N6-甲基腺苷（m6A）。?譜峰顯?了不同的保留時間，說明了HPLC在分析核苷和修飾形式??的多功能性【1】。
2
生物素化寡脫氧核苷酸的合成純化
紫外線誘導的6-4TT聚合后用Venusil MP C18醋酸銨體系純化，采用UHPLC-Q-TOF/MS對制備的含ODN的6-4TT進行表征和堿性穩定性驗證。生物素化的含6-4TT的寡脫氧核苷酸被用于篩選針對6-4TT光產物的高親和力抗體。預計該合成的探針可用于檢測與該病變結合的蛋白質并評估6-4TT DNA螺旋構象的影響【3】。
“
3
（化學）酶促合成是傳統化學方法的寶貴替代方案，但由于生物催化劑的生產成本過高，降低了此類工藝的可行性。然而在連續酶膜反應器（EMR）中可以提高生物催化劑使用率直到其失活，因此它們為使用自由溶解的酶進行間歇酶促反應提供了一種有價值的替代方案。在EMR中，酶通過合適的膜保留在反應器中。因此，可以避免載體材料上進行固化，以及酶活性的相關損失。使用自由溶解酶的EMR應用，有助于集成生物催化劑分離的連續過程，從而降低生物催化劑的總體成本并增強核苷生產的下游加工【2】。
