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【飛諾美色譜】RP-LC-MS/MS法定量mRNA中游離/非結合核苷
更新時間：2024-12-10
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這種方法可以檢測和定量合成類mRNA中大多數修飾的核苷。這不僅包括在體外轉錄過程中有意通過三磷酸鹽引入的修飾，還包括商業化NTP原料變化引入的雜質，核苷被氧化產生的雜質等。該方法還能檢測從帽結構釋放的m7G或核糖甲基化修飾。使用LC-MS/MS，可以在核苷水平上分析mRNA，從而在單次運行中檢測和量化數十種不同的修飾核苷。該方法可以很容易地對體外轉錄的NTP進行質量控制。
溶液A：5mM醋酸銨緩沖液。乙酸調pH到5.3
溶液B：乙腈。必須使用LC-MS級
梯度條件：見下表
樣品制備
用0.6U的核酸酶P1、0.2U的蛇毒磷酸二酯酶、0.2U的牛腸磷酸酶和10U的Benzonase核酸酶，在5mM Tris （pH8）和1mM氯化鎂溶液中，37℃酶解2小時，將10μg的RNA酶切至核苷水平。另外，可以選擇性地添加脫氨酶抑制劑，如噴司他汀（腺苷脫氨酶抑制劑，200ng）和四氫尿苷（胞苷脫氨酶抑制劑，500ng），以避免核苷降解。
標樣：腺苷或另一種主要核苷（C, U或G）
色譜系統
色譜柱：Synergi Fusion, 4μm, 80?孔徑, 250×2.0mm; Phenomenex
柱溫：35℃
流速：0.35mL/min
檢測器：UV 254nm
儀器參數
質譜儀：配備電噴霧離子源（ESI）的三重四極桿
模式：正離子模式，dMRM（動態多反應監測）
ESI參數：氣體溫度300℃，氣體流量7L/min，霧化器壓力60psi，鞘氣溫度400°C，鞘氣流量12L/min，毛細管電壓3000v，噴嘴電壓0v
QQQ參數：取決于必須檢測的修飾核苷。建議對每臺質譜儀的儀器參數（破碎器、碰撞能量、加速器電壓）進行優化，以達到最佳靈敏度
分析——相對定量
用MS/MS法測定各修飾核苷的峰面積。
修飾核苷的量用腺苷校正，以消除進樣量不同帶來的差異。為此，從254nm處記錄的紫外色譜中獲取腺苷的峰面積。
通過在每個樣品中加入同位素標記的標準物進行定量。
A(MS mod)=修飾核苷酸的MS峰面積
n(ISTD)=每個樣品的內標量
A(MS ISTD)=內標質譜峰的面積
A(UV腺苷)=腺苷的峰面積
或者，可以選擇另一種主核苷（C、U或G）進行校正。例如，在酶促多聚腺苷酸化的情況下，它會導致未知或不同數量的腺苷。
分析——絕對定量
用MS/MS法測定各修飾核苷的峰面積。
修飾核苷的量用腺苷校正，以消除進樣量不同帶來的差異。為此，從254nm處記錄的紫外色譜中提取腺苷的峰面積。
使用外部校準溶液進行絕對定量。準備濃度為0.1、0.5、1、5、10、50、100和500nM的校準溶液，用于MS/MS檢測修正，每個修飾含有等量的內標。
每種稀釋液注入10μL，在1-5000fmol范圍內進行校準。對于腺苷，準備濃度為0.1、1、10和100fmol的校準溶液。每種稀釋液注入5μL，在0.5-500pmol范圍內進行校準。響應因子對應于校準曲線線性擬合的斜率（峰面積對應于各自的量）。
X(每個修主核苷的修飾量)=絕對定量，每個主核苷修飾量
A(MS mod)=各自修飾的MS峰面積
A(MS ISTD)=內標質譜峰的面積
n(ISTD)=每個樣品的內標量
rf(MS mod/MS ISTD)=各自修飾物與內標物之比的響應因子
A(UV腺苷)=腺苷的紫外峰面積
RF(UV腺苷)=相應修飾的響應因子
對于已定義的已知序列的mRNA：
修飾核苷的數量可以歸一化為RNA分子的數量。
X(mod/RNA)=絕對定量，每個RNA分子的修飾量
N(腺苷)=RNA序列中各自修飾的數目
或者，可以選擇另一種主核苷（C、U或G）進行歸一化。防止在酶促聚腺苷酸化的情況下，導致未知數量的腺苷。
